Логотип

Влияние секрета слюнных желез медицинской пиявки

И.П. Баскова, К.В.Гольцова, Л.Л. Завалова, Л.Г. Климович.
Влияние секрета слюнных желез медицинской пиявки на состояние тучных клеток подкожной клетчатки крысы.



Впервые показано, что секрет слюнных желез медицинской пиявки, представляющий поликомпонентную систему белков и низкомолекулярных соединений, активирует тучные клетки подкожной клетчатки крысы in vitro, вызывая снижение степени их насыщения гепарином и увеличивая характерные для активации морфометрические параметры этих клеток. Аналогичные изменения тучных клеток выявлены при анализе образцов подкожной клетчатки в месте повреждения кожного покрова крысы укусом пиявки и показано, что они сохраняются в течение 3 дней. Механическое повреждение кожи крысы не приводит к активации тучных клеток. Активирующее тучные клетки воздействие секрета слюнных желез (ССЖ) распространяется на далеко отстоящие тучные клетки подкожной клетчатки, что выражается в резком, хотя и статистически недостоверном, снижении индекса насыщения их гепарином. Вторичная постановка пиявок на эти отстоящие участки кожи приводит к снижению степени активации тучных клеток и, как следствие, к некоторому снижению уровня гепарина в вытекающей из ранки крови (0.154±0.03 ед/мл, n=10) по сравнению с гепарином крови из первичной ранки, нанесенной пиявкой (0.160±0.03 ед/ мл, n=10). Полученные результаты позволяют предположить участие гепарина, высвобождающегося из гранул активированных тучных клеток, в обеспечении пост-пиявочной кровоточивости, явления, обеспечивающего разгрузку капиллярного бассейна при гирудотерапии, методе лечения различных заболеваний путем приставления медицинских пиявок.

Ключевые слова: тучные клетки, секрет слюнных желез, медицинская пиявка, гепарин.

тучные клетки, секрет слюнных желез, медицинская пиявка, гепаринМедицинская пиявка (Hirudo medicinalis) является эффективным средством лечения многих заболеваний, практически лишенным отрицательных побочных действий. Интерес к этому необычному «лекарству» в последние годы возрастает в связи с публикациями, посвященными изучению уникальных биологически активных соединений, продуцируемых этим животным [6,7,13,19,24]. В результате многовековой адаптации к питанию исключительно кровью теплокровных организмов, секрет слюнных желез животного оказался источником сбалансированного набора биологически активных соединений, обеспечивающих не только регуляцию свертывания насасываемой пиявкой крови, но и влияющим на многие жизненно важные процессы организма хозяина, в том числе и человека. Особое место принадлежит способности секрета подавлять защитные функции кожного покрова, которые в значительной степени обеспечиваются тучными клетками подкожной клетчатки [20]. Ротовой аппарат медицинской пиявки устроен таким образом, что при прокусывании кожи с помощью трех челюстей в ранку изливается секрет слюнных желез через протоки, выход из которых находится в вершине каждого из 240 челюстных хитиновых зубчиков [21]. Поскольку глубина ранки, наносимой укусом пиявки, сопоставима с глубиной расположения тучных клеток в дерме кожного покрова хозяина [21], воздействие пиявочного секрета на тучные клетки дермы несомненно. Однако, состояние тучных клеток в области постановки пиявок никем ранее не изучалось. Нами впервые проведено исследование состояния тучно-клеточной популяции подкожной клетчатки крысы в результате взаимодействия с пиявочным секретом в экспериментах in vitro и при их анализе в участке раневой поверхности кожи, вызванной укусом пиявки и введением секрета.

Феноменом является и пост-пиявочная кровоточивость, существенный фактор лечебного действия медицинской пиявки, обеспечивающий разгрузку капиллярного бассейна. Однако механизм его пока остается невыясненным. Представления о том, что он обусловлен антикоагулянтами секрета слюнных желез, адсорбированными на тканях раневой поверхности, справедливы только для первых порций вытекающей из ранки крови [10]. Существует также гипотеза о том, что пост-пиявочная кровоточивость обусловлена вазодилатацией, в области ранки, стимулированной гистамином [17]. В настоящей работе впервые сделана попытка связать пост-пиявочную кровоточивость с высвобождением гепарина при активации тучных клеток подкожной клетчатки секретом слюнных желез медицинской пиявки.

Методика

Секрет слюнных желез медицинской пиявки отбирали у голодных животных, выращенных на биофабрике «ГирудИ.Н.» (г.Балаково Саратовской области) [1]. Высокомолекулярную фракцию пиявочного секрета, отобранного от пиявок, получали по методу [2], путем ультрафильтрации на приборе Minitan (Millipore, США), используя мембрану 500 Да (Spectra Medical Industries Inc., США). Для электрофоретического анализа ВМФ (высокомолекулярной фракции) секрета его концентрировали осаждением белков смесью метанола с хлороформом.

Элекрофорез проводили по методу U.K.Laemmly [14] с использованием

9-16 %-ного градиентного полиакриламидного геля с нанесением 25 и 50 мкг белка и смеси маркерных белков 14 - 97 кДа (Amerscham, США). Сканирование гелей проводили на денситометре Epson 1600 (Япония). Анализ гелей и денситометрирование дорожек проводили с использованием программы «LabWorks 4.0».

В работе c животными использовали самцов нелинейных белых крыс массой тела 180 - 200. Пиявок приставляли к участку выбритой поверхности кожи бедра животного на 20 мин. Пост-пиявочную кровь, вытекающую из ранки, нанесенной укусом пиявки, собирали в пробирки Eppendorf, смешивая ее с

3. 8 %-ным раствором трехзамещенного цитрата натрия в отношении 9:1.

Препараты подкожной клетчатки крысы получали от крыс по методу Д.И.Линдера и сотр. [5]. Вырезанные участки интактной подкожной клетчатки или подкожной клетчатки непосредственно в области постановки медицинской пиявки (после 30-минутной пост-пиявочной кровоточивости) растягивали на предметных стеклах и фиксировали раствором формалина (рН 7.4) в течение 35 мин. После отмывания их окрашивали 0.1% водным раствором толуидинового синего (рН 4.9), красителем на гепарин. Спустя сутки препараты фиксировали путем нанесения капли канадского бальзама и накрывали покровным стеклом.

Морфометрический анализ функционального состояния тучноклеточных популяций препаратов подкожной клетчатки крыс проводили по методу, описанному Д.И.Линдером и сотр. [5]. Морфометрические критерии, характеризующие функциональный статус тучноклеточной популяции, получали на основе подсчета в среднем 200 клеток каждого пленочного препарата, используя микроскоп МИКМЕД-1. По степени метахромазии клетки в каждой популяции распределяли по 4 группам:
«очень темные», насыщенные гепарином клетки, плотно заполненные интенсивно окрашенными гранулами; отдельные гранулы и ядро неразличимы;
«темные» клетки, в которых можно различить отдельные гранулы и в которых слегка просматривается ядро;
«светлые» клетки, рыхло заполненные хорошо различимыми гранулами с менее интенсивной окраской и с отчетливо видным ядром;
«очень светлые», опустошенные клетки с небольшим количеством окрашенных гранул.

Рассчитывали следующие параметры тучных клеток:

а) индекс насыщения гепарином (ИНГ) (отношение суммы «очень темных» и «темных» клеток к сумме «светлых» и «очень светлых» клеток)

б) индекс дегрануляции (ИД) или апокриновую секрецию клеток (отношение количества дегранулированных клеток к общему количеству анализированных клеток)

в) индекс гранулолизиса (ИГр)(отношение количества «очень светлых» клеток к числу всех подсчитанных клеток в популяции

г) индекс суммарного гранулолизиса (ИСГр) или мерокриновую секрецию (отношение суммы «светлых» и «очень светлых» к общему количеству анализированных клеток).

Содержание гепарина в плазме пост-пиявочной крови определяли на автоматическом коагулометре ACL2000 (CША), используя инструкцию и необходимые реактивы фирмы «Instrumentation Laboratory». Оценивали способность гепарина этой плазмы ингибировать активность добавленного фактора Ха в присутствии антитромбина III, о чем судили по остаточной активности фактора Ха, определемой с помощью хромогенного субстрата S-2765 (N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·HCl). Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты исследования.

Влияние секрета слюнных желез медицинской пиявкиХарактеристика ССЖ (секрета слюнных желез). На рис.1 представлена денситограмма одномерного электрофореза препарата высокомолекулярной фракции ССЖ при нагрузке 25мкг (А) и 50 мкг (Б).

Видно, что эта фракция представляет мультикомпонентную систему белков в области молекулярных масс от 6 до > 200 кДа.

Воздействие ССЖ на тучные клетки подкожной клетчатки крысы in vitro.

Препараты подкожной клетчатки крысы погружали в 0.4 мл раствора ССЖ и инкубировали при 37 0С в течение 15, 30, 60 и 90 мин. Контролем служили эксперименты, в которых аналогичные препараты подкожной клетчатки инкубировали с 0.4 мл физиологического раствора при 37 0С в течение 15, 30, 60 и 90 мин. На рис. 2 представлена динамика изменения морфометрических показателей тучных клеток после их инкубации c CCЖ. Статистически достоверное уменьшение индекса насыщения гепарином, повышение индекса дегрануляции и суммарного индекса гранулолизиса свидетельствуют об активации тучных клеток секретом слюнных желез медицинской пиявки [5].

Состояние тучных клеток подкожной клетчатки крысы в месте нанесения укуса медицинской пиявкой. В таблице представлены морфометрические показатели серии препаратов тучных клеток подкожной клетчатки в области бедра крысы в месте укуса пиявки спустя 30 мин после ее снятия и серии аналогичных препаратов, полученных спустя 3 дня после нанесения укуса пиявкой. В последней серии опытов ранку, нанесенную пиявкой, временно заклеивали пластырем. В качестве контроля использовали интактную кожную клетчатку, взятую со спины крысы. Чтобы исключить влияние механического повреждения кожи на состояние тучных клеток подкожной клетчатки, крысам в области бедра делали надрез микроножницами, соизмеримый с повреждением кожного покрова медицинской пиявкой, и анализировали морфометрические показатели тучных клеток.

Как видно из приведенных результатов, имеет место активация тучных клеток только в области постановки пиявки, которое сопровождается повреждением кожного покрова. Механическое повреждение не вызывает изменений морфометрических показателей тучных клеток. Заслуживает внимания факт сохранения активации тучных клеток спустя 3 дня после снятия пиявки. Степень насыщения гепарином при этом оказалась даже несколько пониженной по сравнению с таковой в клетках, анализированных спустя 30 мин после снятия пиявки, индекс дегрануляции был снижен до нормы. Хотя индекс суммарного гранулолизиса практически не отличался от такого у клеток, анализированных спустя 30 минут после снятие пиявки, индекс гранулолизиса оказался аномально высоким.

Влияние пиявочного укуса на активацию отдаленных тучных клеток. В данной серии экспериментов пиявку на 20 мин приставляли к внешней стороне бедра крысы и после 30- минутной пост -пиявочной кровоточивости брали образцы подкожной клетчатки не только в месте укуса, но и интактного кожного покрова с внутренней стороны этого же бедра (опыт 1 на схеме к рис.3). Аналогичные эксперименты проводили на серии крыс, которым на 20 мин приставляли пиявку к внешней стороне бедра; после остановки пост-пиявочной кровоточивости ранку заклеивали пластырем и спустя 3 дня брали образцы кожи как в месте пиявочного укуса, так и интактной подкожной клетчатки с внутренней стороны того же бедра крысы (опыт 2 на схеме к рис.3). Контролем служили образцы кожного покрова, взятые со спины того же самого животного. Результаты анализа морфометрических показателей, представленные на диаграмме (рис.3), подтверждают данные, полученные в предыдущих экспериментах (таблица), о сохранении состояния активации тучных клеток в месте постановки пиявки не только спустя 30 мин (за исключением Игр (Индекса гранулолизиса)), но и через 3 дня (за исключением ИД (Индекса дегрануляции)). Что касается влияния на отдаленные участки кожного покрова, изменения морфометрических показателей тучных клеток по сравнению с контролем оказываются статистически недостоверными, хотя наблюдалось выраженное снижение индекса насыщения гепарином.

Влияние повторного (через 3 дня) приставления пиявки одному и тому же животному на состояние тучных клеток. Животному приставляли пиявку на область левого бедра с экспозицией 20 мин (первичная постановка пиявки), после пост-пиявочной кровоточивости ранку заклеивали пластырем. Спустя 3 дня этому же животному приставляли пиявку на правое бедро также с экспозицией 20 мин (вторичная постановка пиявки) и после 30-минутной пост-пиявочной кровоточивости вырезали участки кожи в областях обоих укусов. В качестве контроля использовали интактную подкожную клетчатку, взятую со спины животного. Результаты определения морфометрических показателей тучных клеток представлены на диаграмме (рис.4).

Сравнение результатов, полученных на двух опытных группах, свидетельствует о том, что ИНГ (Индекс насыщения гепарином) достоверно снижается в обеих группах по сравнению с контролем. Однако повышение ИД в 10 раз по сравнению с контролем наблюдается только в группе животных после вторичной постановки пиявки (на левое бедро) спустя 30 мин после снятия пиявки. В то же время ИГр в образцах подкожной клетчатки, взятых спустя 3 дня после первичной постановки пиявки (на правое бедро), увеличивается в 5 раз, а в образцах, взятых спустя 30 мин (вторичная постановка на левое бедро), не отличается от контроля. Увеличение ИСГр в обеих опытных группах, практически одинаковое.

Содержание гепарина в пост-пиявочной крови крыс. Анализировали содержание гепарина в пост-пиявочной крови как один из возможных факторов, обеспечивающих продолжительное несвертывание крови, вытекающей из ранки, нанесенной пиявочным укусом. Определяли содержание гепарина в крови, вытекающей из ранки, нанесенной крысе первичным нарушением кожного покрова с внешней стороны бедра животного в результате 20-минутного насасывания пиявкой крови, и вторичным, спустя 3 дня, путем приставления пиявки на 20 мин к внутренней стороне бедра той же самой крысы. Контролем служила венозная кровь крысы. В венозной крови, взятой как до постановки пиявки, так и после первичной и вторичной постановок, гепарин обнаружен не был (n=10). В крови, вытекающей из ранки после первичной постановки пиявки, количество гепарина составляло 0.160±0.03 ед/ мл (n=10), после вторичной постановки пиявки тому же животному, его содержание было равно 0.154±0.03 ед/ мл (n=10).

Обсуждение результатов

Морфометрические показатели тучных клеток оценивали с помощью окрашивания гепарина, одного из компонентов их внутриклеточных гранул [ 14]. Представленные результаты однозначно свидетельствуют о способности ССЖ медицинской пиявки активировать тучные клетки, снижая клеточные запасы гепарина путем его секреции в составе гранул (дегрануляция) и непосредственного высвобождения во внеклеточное пространство (гранулолизис). Как видно из опытов in vitro, активация происходит в первые 15 мин и остается на одном уровне в течение фиксированных 90 мин. Исключение составляет индекс дегрануляции тучных клеток, который выходит на плато к 60-й минуте инкубации с ССЖ (Рис.1, Б).

Анализ морфометрических показателей тучных клеток непосредственно в области ранки, нанесенной укусом пиявки, также свидетельствует об их активации (см.таблицу). Этот эффект не может быть объяснен механическим повреждением кожного покрова крысы пиявочным укусом, поскольку нанесение аналогичного механического повреждения на кожу крысы не вызвало активации тучных клеток в этом месте (см. таблицу). Следовательно, в месте прокусывания кожного покрова имеет место активация тучных клеток подкожной клетчатки, стимулированная ССЖ, который попадает в ранку через протоки этих желез, выходы из которых расположены на вершине каждого зубчика [7]. Подтверждением выброса ССЖ при повреждении кожи пиявочным укусом служит описанный нами способ его получения в результате прокусывания пиявкой пленки, имитирующей кожный покров [2].

Существенным представляется тот факт, что спустя 3 дня после воздействия активирующего стимула тучные клетки сохраняют состояние «активации»: остаются статистически значимыми анализируемые морфометрические параметры за исключением индекса дегрануляции, а индекс гранулолизиса даже возрастает в несколько раз (см. таблицу). ИД спустя 3 дня после постановки пиявки не отличается от контроля и в следующем эксперименте, представленном на Рис.3. Это свидетельствует о том, что дегрануляция тучных клеток фиксируется не позднее, чем через 30 мин после активирующего действия ССЖ медицинской пиявки.

Механизм распространения ССЖ , попадающего в ранку при гирудотерапии (методе лечения путем приставления медицинских пиявок к определенным областям кожного покрова больного), является ключевым вопросом данного раздела медицины, поскольку гуморальное действие ССЖ в значительной степени обеспечивает эффективность лечебного метода. Из данных литературы известно, что «фактором распространения» в составе ССЖ является гиалуронидаза, которая в составе экстракта из медицинской пиявки в экспериментах A.Claude ускоряла лимфоток у кролика [8]. В связи с этим представлялось необходимым проанализировать, является ли активирующее действие ССЖ на тучные клетки строго локальным или способно распространяться на отдаленные тучные клетки. Результаты экспериментов, представленные на рис.3 , свидетельствуют о том, что определенное воздействие со стороны ССЖ, инъецированного пиявкой на внешней стороне бедра крысы, испытывают дистальные тучные клетки, расположенные на внутренней стороне бедра: наблюдается снижение ИНГ и спустя 30 мин, и спустя 3 дня после постановки пиявки, хотя эти значения и не являются статистически значимыми.

Если спустя 3 дня после постановки пиявки на левое бедро повторно поставить пиявку на правое бедро и спустя 30 мин проанализировать состояние тучных клеток по параметрам: ИНГ, ИГр и ИСГр, то активация тучных клеток, в месте первичной постановки пиявки оказалась более выраженной, чем в месте вторичной ее постановки (Рис.4). Исключение составляет ИД как срочная ответная реакция тучных клеток на активирующий стимул. Повышение ИД наблюдается только в экспериментах, когда тучные клетки анализируются непосредственно в месте укуса пиявки спустя 30 мин (Рис.3, см. таблицу).

Представленные результаты позволяют полагать, что снижение кровоточивости у больных при повторных постановках пиявок [4] может объясняться истощением гепарина в гранулах тучных клеток подкожной клетчатки, отстоящих от места нанесения пиявочного укуса. На это указывают и наши результаты по оценке его содержания в пост-пиявочной крови: количество гепарина в крови, вытекающей из ранки после первичной постановки пиявки, несколько выше, чем в крови, вытекающей из ранки после повторной ( через 3 дня) постановки пиявки на противоположное бедро той же самой крысе.

Следует отметить, что мы впервые соотнесли явление пост-пиявочной кровоточивости с процессом активации тучных клеток и перераспределением содержания в них гепарина, о чем судили по морфометрическим показателям тучно-клеточной популяции подкожной клетчатки крысы. Необходимы дальнейшие исследования параметров пост-пиявочной крови чтобы оценить регуляторную роль ССЖ медицинской пиявки в этом процессе.

С другой стороны, необходим структурно-функциональный анализ ССЖ пиявки для понимания механизма активации тучных клеток подкожной клетчатки. В настоящей работе мы анализировали высокомолекулярную (мол. масса >500 Да) фракцию пиявочного секрета и показали присутствие в ней множества белков с мол. массами от 6 до >200 кДа (см. рис.1). При анализе этой фракции секрета с помощью технологии белковых чипов определено 45 соединений с молекулярными массами от 1964 Да до 66,5 кДа [3]. Сопоставление этих результатов с данными литературы выявило соответствие полученных пиков только с 8 известными белками, выделенными из медицинской пиявки: ингибитором триптазы [22] , бделластазином [18], гирудином [15], саратином [9], дестабилазой-лизоцимом [24], гиалуронидазой [23], калином [16] и γ-глутамил-транспептидазой [11]. Эти данные, с одной стороны, свидетельствуют о несомненном присутствии перечисленных выше белков в составе ССЖ, а с другой — о том, что ССЖ является источником множества белков, функции которых пока остаются неизвестными. Что касается компонентов низкомолекулярной фракции ССЖ, методами протеомного анализа показано, что их количество насчитывает несколько сотен (Баскова и др., неопубликованные данные).

Таким образом, в результате изучения влияния ССЖ медицинкой пиявки на состояние тучно-клеточной популяции подкожной клетчатки крысы впервые показано, что одним из результатов адаптации медицинской пиявки к питанию кровью теплокровных является продолжительная, в течение 3 дней, активация тучных клеток. При этом из тучных клеток секретируется не только гепарин, но и множество биологически активных соединений [16], некоторые из них взаимодействуют с компонентами ССЖ. Так, например, идентифицированные нами в составе ССЖ ингибитор триптазы и бделластазин препятствуют действию секретируемых тучными клетками протеолитических ферментов [12], снижая их защитные функции. Несомненно. что гуморальное действие ССЖ, обеспечивающее лечебный эффект гирудотерапии, в определенной степени связано с его воздействием на тучные клетки подкожной клетчатки.

Поступила 18 VIII 2004

Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 99-04-48695 и № 00-04-48166).

Добавить комментарий

Защитный код
Обновить






  • 1
  • 2
  • 3
Пред След

ПИЯВКИ – ПАНАЦЕЯ ДЛЯ ИМПЕРАТОРОВ

23-04-2013 Просмотров:4936 О гирудотерапии со всего света Super User

ПИЯВКИ – ПАНАЦЕЯ ДЛЯ ИМПЕРАТОРОВ

Старинный метод лечения пиявками (гирудотерапия) сейчас используется наряду с самыми современными. А ведь известен он со времен египетских фараонов, использовался для лечения византийских императоров. Одно Время этот метод лечения был...

Подробнее »

Авицена Канон врачебной науки "о Пиявках"

11-04-2013 Просмотров:5507 О гирудотерапии со всего света Super User

Авицена Канон врачебной науки "о Пиявках"

Гениальный труд Ибн Сины «Канон врачебной науки» – величайший по значению и содержанию памятник культуры – написан в 1012-1024 годах. Этот колоссальный свод медицинских знаний представляет собой одну из вех...

Подробнее »

Причины проблем с потенцией и их решение

14-05-2013 Просмотров:20091 Полезные статьи Super User

Причины проблем с потенцией и их решение

Согласно статистике, сегодня средний возраст мужчин с жалобами на ослабление потенции, составляет 40-45 лет. Врачи подтверждают, что в условиях современной жизни потенция мужчины «стареет» и угасает на десятилетия быстрее, чем...

Подробнее »







Последние сообщения на форуме гирудотерапии

Нет сообщений для показа